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Vacuolação autofágica induzida por excesso de geração de ROS em HABP1 / p32 / gC1qR Sobreexpressão de fibroblastos e sua reversão por Hyaluronan polimérico.
Concebido e projetado os experimentos: KD IG PS. Realizou as experiências: PS ARC SD SC. Analisou os dados: PS ARC SD SC IG KD. Contribuição de reagentes / materiais / ferramentas de análise: KD IG. Escreveu o manuscrito: PS KD IG.
A hialaderina ubíqua, proteína de ligação a hialuronano 1 (HABP1 / p32 / gC1qR) após a sobreexpressão estável em fibroblastos normais (F-HABP07) foi relatada como induzindo disfunção mitocondrial, retardo de crescimento e apoptose após 72 h de crescimento. HABP1 foi observado para se acumular na mitocôndria resultando em geração de Excesso de espécies de oxigênio reativo (ROS), efluxo de Ca ++ mitocondrial e queda no potencial de membrana mitocondrial. No presente estudo, a vacuolagem autofágica foi detectada com coloração com monodansilcadaverina (MDC) de 36 h a 60 h de período de cultura, juntamente com o nível elevado de ROS em células F-HABP07. Aumento da expressão de marcadores autofágicos como MAP-LC3-II, Beclin 1 e modulador autofágico, DRAM confirmou a ocorrência do fenômeno. A formação de vacuolo reduzida foi observada após o tratamento com 3-MA, um inibidor conhecido de PI3-quinase, apenas às 32 h e foi ineficaz se tratado mais tarde, já que o nível de ROS elevado já foi atingido. O tratamento de células F111 e F-HABP07 com bafilomicina A1 indicou ainda um aumento na formação de autofagosomas juntamente com a degradação autofágica em fibroblastos sobre-expressos HABP1. A comparação entre células normais de fibroblastos (F111) e F-HABP07 indica um nível reduzido de HA polimérico, sua despolimerização e interação HA-HABP1 perturbada em F-HABP07. Curiosamente, a suplementação de HA polimérico, um eliminador de ROS endógeno, no meio de cultura, induziu redução no número de vacúolos em F-HABP07, juntamente com a queda no nível de ROS, implicando que o excesso de geração de ROS desencadeia a iniciação da formação de vacúolos autofágicos antes da apoptose devido à sobreexpressão de HABP1. Assim, o fenômeno da autofagia ocorre antes da indução da apoptose na linha celular sobreexpressora HABP1, F-HABP07.
Introdução.
O glicosaminoglicano, o hialuronano (HA), um antioxidante endógeno [1 - 3] regula várias vias celulares através de uma bateria de proteínas de ligação a HA ou x091818; hialadherinas & # x02019; [4]. A depolimerização de HA ocorre principalmente por OH & # x002d9; ataque em múltiplos locais dentro da estrutura de HA e os produtos formados finalmente causam a clivagem de ligações glicosídicas através de "oligómeros de HA que geram geração" [5, 6]. Foram observados oligómeros de HA de 2,5 X 10 3 para inibir o crescimento independente da ancoragem de células tumorais e induzir apoptose [7], embora o HA polimérico tenha sido implicado na proliferação celular [8, 9]. Proteína 1 de ligação à hialuronina (HABP1), uma fosfoproteína glicosilada de 34 kDa e um membro da hialadherina & # x02018; # x02019; família de proteínas, interage com hialuronano (HA) [10] e está envolvido na sinalização celular. HABP1 mostra uma identidade de sequência de cDNA completa com p32, uma proteína co-purificada com o factor de emenda SF2 e gC1qR, o receptor humano para a cabeça globular do factor de complemento 1q [11-13], representado assim como HABP1 / p32 / gC1qR em o Genoma Humano. O gene que codifica HABP1 está localizado no cromossomo 17p12-p13 com GenBank ID:> AF275902 [14]. A estrutura de cristal de HABP1 / p32 revela-se como um trímero, com os três monómeros formando uma estrutura quaternária em forma de rosca com uma distribuição de carga assimétrica na superfície que envolve um canal central [15]. Embora o HABP1 se localize principalmente na matriz mitocondrial, mas sua presença também foi relatada na superfície celular, núcleo e citosol, sugerindo uma capacidade de ligação de um miríneo atribuindo à sua natureza multifuncional [9,16-18]. A análise de seqüência de HABP1 revelou vários locais para a fosforilação de CKII e um local de substrato para MAPK [160 PELTSTP 166]. HABP1 foi relatado como um substrato endógeno para MAPK e após estimulação mitogênica, transloca para o núcleo de forma dependente de MAPK em células HeLa e F111 [19]. A expressão constitutiva de HABP1 / p32 / gC1qR em fibroblastos normais perturba suas características de crescimento e induz apoptose a 60 h como indicado pelo aumento da expressão de Bax e das células TUNEL positivas [20]. Além disso, observou-se que o HABP1 se acumula nas mitocôndrias levando à geração de espécies de oxigênio reativo (ROS), aumento do influxo de Ca ++ nas mitocôndrias, resultando em queda de potencial de membrana criando disfunção mitocondrial [16]. Pelo contrário, as células HepG2, contendo um nível endogenamente alto de uma série de enzimas antioxidantes que sobreexpressam estável HABP1, não conduzem à geração de ROS, estresse celular e apoptose, e são de natureza mais proliferativa com HA aumentada de polímero do que a linha celular original [9] .
ROS, considerado como um indutor de estresse metabólico e autofagia, atua como um mecanismo de amortecimento sob tais estresses por meio de metabolização de nutrientes resultantes da degradação macromolécula. Duas principais rotas de degradação em eucariotas que mantêm a homeostase são os sistemas proteossômicos e lisossômicos. O sistema lisossômico ou autofagosomático é responsável pela degradação de proteínas de longa duração, que representa a grande maioria das proteínas celulares e para o turnover de organelas [21-24]. A natureza altamente reativa de ROS atribui tanto às suas propriedades destrutivas quanto ao seu funcionamento como uma molécula de sinalização. O aumento do nível de ROS foi sugerido para ser um dos principais reguladores da autofagia por vários estudos [25-28] e estão sendo feitas tentativas para desenvolver o papel da autofagia na morte celular induzida pelo estresse oxidativo. O PI 3-quinase Classe III foi implicado na produção de ROS, resultando em estimulação da autofagia [25]; enquanto, vários estudos no passado sugeriram a classe I PI3-quinase como um inibidor da autofagia [29,30]. Um dos reguladores da autofagia é o supressor de tumores Beclin 1, homólogo de levedura Apg6 que forma um complexo com cinase PI3 de classe III e, segundo os indícios, induz a autofagia [31,32]. smARF, o produto da iniciação interna da tradução do supressor de tumor p19ARF / p14ARF atua como indutor de autofagia por geração de ROS após translocação para mitocôndrias. A translocação mitocondrial desta proteína de curta duração ocorre apenas após interação física e estabilização por HABP1 / p32; De outra forma, é de curta duração devido à degradação proteasomal [33, 34].
Excesso de ROS na célula pode desencadear a autofagia e a apoptose [27,28,16] e as células F-HABP07 já foram relatadas para gerar numerosas estruturas vacuolares e sofrer apoptose a 72 h de crescimento [16,20]. A natureza das estruturas vacuoladas é desconhecida e, além disso, o HABP1 foi percebido como tendo um papel na indução de autofagia pela interação com o smARF. Assim, nosso interesse é explorar o papel regulador da sobre-expressão de HABP1 na formação de vacúola autofágica dependente da geração de ROS e se ela pode ser modulada com inibidor de quinase PI3 e antioxidante endógeno.
Materiais e métodos.
Os produtos químicos incluindo os reagentes necessários para cultura celular foram obtidos a partir de Sigma Aldrich Chemicals Pvt. Ltd. (EUA). Os anticorpos primários e secundários foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology Inc. (EUA), Sigma Aldrich Chemicals Pvt. Ltd. (EUA), Abcam (EUA) e Cell Signaling Tech. (EUA). Alexa Fluor 488 e 546, Streptavidin Alexa Fluor 568 foram de Molecular Probes Inc. (Eugene, OR). Oligomeric HA, 12mer (o-HA) foi obtido da Seikagaku Corporation. O marcador de baixo peso molecular foi obtido de Amersham, Reino Unido. As mercadorias de plástico de cultura de células foram obtidas da Corning-Costar Inc. (Corning, NY, EUA). Os filtros de membrana M para meios de filtração e membranas PVDF foram obtidos de Millipore (MA, EUA) 0,22 & # x000b5; A unidade de filtração e a criobox de isopropanol foram adquiridas da Nalgene (NalgeNunc International Corporation, Rochester, NY, EUA). A água utilizada para a preparação de meios e reagentes foi autoclavada triplo destilada (destilada em nosso laboratório) ou Milli Q autoclavada (obtida a partir do sistema de purificação de água, Millipore, MA, EUA).
Manutenção da Linha Celular.
As linhas de células F111, F-pCDNA01 e F-HABP07 [20] foram cultivadas em DMEM de baixa glicose (Dulbecco & # x02019; s Modified Eagle & # x02019; S Medium), contendo 1gm / L de glicose. A mídia foi suplementada com 10% de FBS, 100 \ x003bc; g / ml de estreptomicina e 50 g / ml de fungizona em frascos de cultura de tecidos e pratos. As culturas foram cultivadas a 37 ° C x 100 ° C em atmosfera úmida com 5% de CO 2 e 95% de ar. As células foram mantidas rotineiramente em cultura monocamada e separadas das superfícies plásticas de produtos de cultura de tecidos por tripsinização (tratamento com tripsina-EDTA: 0,25% de tripsina e EDTA 2 mM em PBS 0,01 M, pH 7,2) para sub-cultura regular.
Microscopia eletrônica de transmissão.
As linhas celulares cultivadas durante 60 h foram lavadas três vezes com PBS e fixadas em glutaraldeído a 3% a 4 x000b0; C durante um mínimo de 4 h a uma noite. Após a lavagem, as células foram novamente consertadas durante 2 h em tetraóxido de ósmio a 1% em tampão de fosfato a 4 x000b0; C. Após várias lavagens com PBS, as células foram desidratadas em soluções de acetona graduadas e incorporadas na resina araldite CY212. Secções ultrafinas de 60-80 nm de espessura foram geradas usando Ultracroctomato Ultracut E e as seções foram coradas com acetato de uranilo alcoólico e citrato de chumbo para intervalos de tempo apropriados. As grades foram então examinadas com o Microscópio Eletrônico de Transmissão (Morgagni 268 Model, Philips) operado a 80kV.
Detecção de vacúolos autofágicos por coloração de células com Monodansyl Cadaverin (MDC)
O desenvolvimento de vacúolas autofágicas foi estudado em diferentes pontos de tempo (36, 48, 60 e 72 h) por coloração de células com MDC 0,05 mM. O MDC liga-se especificamente à fosfoetanol amina (PE) na membrana autofágica [35]. As células após a conclusão dos pontos de tempo especificados foram lavadas com PBS (pH 7,2) para remover o meio de cultura. As células foram então incubadas com MDC 0,05 mM em PBS a 37 ° C, x000b0, C durante 10 min. Após a incubação, as células foram lavadas 4 vezes com PBS e imediatamente analisadas por microscopia de fluorescência [comprimento de onda de excitação = 335 nm; Comprimento de onda de emissão = 525nm].
Tratamentos de células.
Para células de tratamento com 3-metil-adenina (3-MA) ​​cresceram em lamínulas esterilizadas numa placa de 12 poços para diferentes pontos de tempo. Após a conclusão do ponto de tempo, a mídia foi aspirada para fora das células, reabastecida com meio de cultura fresco contendo diferentes concentrações de 3-MA (0, 0,1, 1 ou 10 mM) e depois incubada durante 30 min a 37 ° C. As células foram então lavadas 4 vezes com PBS (pH 7,2), fixadas com metanol arrefecido e mantidas a -80 ° C, x000b0; C.
As células F111 e F-HABP07 foram tratadas com o potente inibidor vacuolar H + ATPase de bafilomicina A1 (Baf A1) para avaliar se os autofagosomas aumentados durante 36 e 48 h em células F-HABP07 foram devidos a degradação autofágica ou a inibição da formação de autolossossomas conforme A metodologia sugerida por Rubinsztein et al [36]. As células foram tratadas durante 6 horas com 50 μM de Baf A1 a 36 e 48 h de crescimento e depois colhidas para imunotransferência para comparar a acumulação de MAP-LC3-II nas células tratadas e não tratadas. As células de F-HABP07 mostraram anteriormente acumulação aumentada de MAP-LC3-II durante os períodos de tempo acima mencionados.
Para verificar se a suplementação de HA tem algum efeito sobre o crescimento celular e a morfologia, as células foram cultivadas em placas de 6 poços para o ensaio de ROS e MDC, pratos de cultura de 24 poços para ensaio MTT e placas de cultura de 12 poços para hematoxilina e # x02018; coloração com eosina (H-E). As células foram suplementadas com 150 g / ml de HA polimérico e o-HA a 36 h, crescidas até 60 h e depois submetidas a Ensaio ROS, ensaio de sobrevivência celular (MTT) ou coloração H-E.
Ensaio de ROS intracelular.
A produção intracelular de H 2 O 2 foi detectada por fluorescência de diacetato de 2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceína, éster de acetilo, H 2 DCFDA (10 & # x000b5; M) incubado sob várias condições durante 10 minutos em escuro, conforme relatado anteriormente [16].
Ensaio de sobrevivência celular.
O número igual de células foi semeado em cada poço de um cluster de cultura de 24 poços. As amostras foram coletadas no ponto de tempo requerido em triplicado. 10 \ x000b5; l do brometo de [3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-di fenil tetrazolium de corante tetrazole amarelo], adicionou-se MTT (1 mg / ml) a cada poço e incubou-se a 37 & # x000b0; C por 4 h em uma incubadora de CO 2 humidificada. O precipitado formado foi solubilizado em 150 \ x000b5; l do tampão de solubilização, dimetilsulfóxido (DMSO) após o descarte do meio e depois a absorvância foi registrada a 570 nm.
Análise Morfológica por Hematoxilina & # x02018; Eosina (H-E) Coloração.
As células cultivadas durante o tempo necessário foram fixadas em metanol gelado e processadas para coloração H-E. O metanol foi aspirado, seguido de duas alterações de 99% de etanol durante 2 minutos cada. Em seguida, foram administradas duas mudanças de etanol a 95% durante 2 min. Após a lavagem com água destilada dupla durante 1 min, a hematoxilina foi colocada nos lamínulas e mantida durante 1 min. Após uma lavagem completa em água corrente durante 3 min, Eosin foi colocado e mantido por apenas 30 segundos. As células foram então enxaguadas na água corrente da torneira por 30 segundos. Os passos de desidratação foram seguidos dando duas mudanças de etanol a 95% durante 2 minutos cada e duas vezes duas mudanças de etanol a 99% durante 2 minutos cada. Finalmente, os lamínulos foram montados com 50% de glicerol selados com esmalte de unhas e observados sob microscópio de contraste de fase (Nikon) equipado com a câmera Nikon FX-35W.
Estudo de imunofluorescência das células.
A coloração de imunofluorescência indireta das células foi realizada fixando as células em períodos de tempo específicos com paraformaldeído (2%) e as células foram feitas permeáveis ​​com glicina (0,1 M) e Triton X-100 (0,1%). Todos os produtos químicos e as diluições de anticorpos foram preparados em PBS (pH 7,2). Após o bloqueio com BSA (3%), as células foram incubadas com anticorpo primário específico durante 2 h. O anticorpo secundário criado contra o mouse ou o coelho foi utilizado para a detecção de proteínas. Estes foram marcados com fluorescência com Alexa Fluor 488 ou 546 (Molecular Probes Inc., EUA). Para analisar a morfologia nuclear, DAPI (5mg / ml) (Sigma, EUA) foi adicionado ao deslizamento da cobertura 15 min antes da lavagem do anticorpo secundário. Posteriormente, as células foram lavadas e montadas em 50% de Glicerol em PBS. As imagens de fluorescência foram monitoradas usando um microscópio Axioscope (Carl Zeiss, Alemanha) equipado com epifluorescência e sistema de câmera Axiocam acoplado ao software Axio Vision (Carl Zeiss, Alemanha).
A imunocoloração para HA foi realizada processando as células como mencionado acima para estudo de imunofluorescência até o estágio de bloqueio. As células foram então incubadas com HABP Biotinilado comercialmente disponível durante 1 h, lavadas com PBS e incubadas com anticorpo secundário Streptavidina conjugado com Alexa Fluor 568 (1: 300) durante 1 h. O resto das etapas é semelhante ao mencionado acima.
Análise de imunotransferência.
As amostras de proteína submetidas a electroforese por SDS-PAGE foram electro-transferidas em membrana de nitrocelulose ou PVDF aplicando uma corrente de 0,8mA / h em uma unidade de transferência semi-seca ou unidade de transferência úmida. Após a transferência, a membrana foi bloqueada com 5% de leite seco sem gordura em TBS durante 2 h à temperatura ambiente e incubada com o anticorpo primário desejado durante a noite a 4 x000b0; C. A membrana de PVDF foi então lavada três vezes com TBST (TBS com 0,1% de Tween-20) e incubada durante a noite com anticorpo primário, lavada e depois incubada durante 1 h com peroxidase de rábano ou anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina. Os complexos de anticorpos ligados foram detectados usando o sistema NBT / BCIP ou sistema de quimioluminiscência aumentada (ECL). As diluições primárias de anticorpos utilizadas são 1: 1000 para Beclin 1, MAP-LC3, DRAM, PTEN e p53, enquanto a diluição de 1: 20,000 e 1: 5000 foi utilizada para GAPDH e Tubulina, respectivamente.
Detecção de HA degradada e despolimerizada e separação em um gel gradiente de poliacrilamida.
O método de eletroforese em gel de poliacrilamida para a determinação da massa molecular de HA [37] foi utilizado após a separação da fração HA das células cultivadas usando um procedimento descrito anteriormente [9]. O número igual de células F111 e F-HABP07 foi semeado em placas de cultura e deixado crescer durante 60 h, após o que o meio foi removido e a monocamada lavada suavemente com PBS. Posteriormente, as células foram tratadas com 200 \ x000b5; l de acetato de sódio 50 mM (pH 6,0) contendo 250 \ x000b5; g / ml de proteinase K, 5 mM de EDTA e 5 mM de cisteína. Após a incubação durante 10 minutos a 37 ° C, C, as células foram raspadas e recolhidas em tubos de microcentrífuga, seguidas de incubação durante 5 h a 60 ° C. A inactivação da Proteinase K foi realizada por incubação num banho de água em ebulição durante 10 min seguida por centrifugação a 13 000 rpm. O sobrenadante foi recolhido e tratado com 4 volumes de cloreto de cetilpiridinio a 1% em NaCl 20 mM, durante 1 h à temperatura ambiente e centrifugado a 13 000 rpm durante 15 min. Após o descarte do sobrenadante, lavou-se o precipitado com 1 ml de água, centrifugou-se novamente e dissolveu-se em 50 μg de lâmina de guanidina-HCl 4M. Adicionou-se 900 e x000b5; l de etanol à solução e o tubo foi mantido a -20 ° C 000 x 100 ° C durante uma hora após o que cada amostra foi centrifugada e precipitou-se retido e dissolvido em 50 x 5 000 x 5 de sódio 50 mM acetato (pH 6,7). Esta fração foi utilizada como amostra não digerida. As alíquotas de volume igual a partir destas foram então processadas para a digestão de hialuronano usando 50 μg / ml de hialuronidase testicular bovina (BTH) durante 1 h a 37 ° C. Foram carregados volumes iguais de ambos os produtos não digeridos e digeridos com BTH derivados de duas linhas celulares em um gel de gradiente de 5-20% como descrito anteriormente [37], juntamente com o HA polimérico comercialmente disponível digerido e não digerido por BTH de um cordão umbilical humano que atua como positivo controles. O gel foi então corado com 1% de azul de Alcian em ácido acético a 3%, descodificado e posteriormente corado com nitrato de prata [37].
Análise estatística.
O software ImageJ foi utilizado para calcular a variação relativa da dobra nas imunotransferências. Os valores médios de três observações são indicados nas figuras. Os resultados do ensaio foram analisados ​​pelo teste T-ANOVA de uma via ou Student, quando aplicável para avaliar as diferenças entre o controle e a amostra de teste. O nível de significância foi definido em p & # x0003c; 0.05, a menos que seja mencionado de outra forma.
A superexpressão de HABP1 em Fibroblastos normais induz a formação de vacúolos autofágicos.
O fibroblasto transfectado de forma estável (F-HABP07) já foi relatado [16,19] para ter uma morfologia alterada com numerosas estruturas vacuolares. A natureza dessas estruturas vacuolares não foi identificada anteriormente. A Figura 1A mostra a diferença morfológica entre o fibroblasto normal e transformado após a coloração de H-E. O composto auto-fluorescente, MDC foi utilizado para a marcação intracelular de vacúolos autofágicos. O MDC liga-se especificamente à fosfatidiletanol amina (PE) na membrana vacuolar autofágica. As organelas marcadas com MDC contêm a fosfatase ácida de enzima lisossômica e a forma madura da catepsina D. O desenvolvimento de vacúolos autofágicos em diferentes pontos de tempo (36, 48, 60 e 72 h) foi estudado por coloração de células vivas com MDC 0,05 mM. Após a análise microscópica de fluorescência, verificou-se que HABP1 sobreexpressão de células F-HABP07 a 36, ​​48 e 60 h de crescimento mostra colorao positivo de MDC (Figura 1B) e não a 72 h de crescimento, em vez disso, sofre a apoptose como relatado anteriormente [16]. Tanto os fibroblastos normais (F111) como o fibroblasto transformado vetorial (F-pCDNA01) não apresentam qualquer coloração positiva com MDC. As micrografias eletrônicas de transmissão das linhas celulares F111, F-HABP07 e F-pCDNA01 cultivadas durante 60 h revelaram a presença de vacuolas autofágicas apenas em células F-HABP07, como indicado com setas amarelas na Figura 1C.
Aumento da expressão de marcadores autofágicos Beclin 1 e MAP-LC3-II em células F-HABP07.
Depois de confirmar a presença de vacuolação autofágica por coloração com MDC, verificou-se o perfil de expressão do marcador autofágico Beclin 1. Beclin 1, um homólogo para Apg6 e um membro importante do complexo de iniciação para máquinas autofágicas, é relatado como sendo excluído monoleleicamente em vários tipos de câncer. Os lisados ​​de células inteiras de células F111 e F-HABP07 crescidas durante 36, 48 e 60 h foram imunotransferidos com anticorpo Beclin 1 e anticorpo GAPDH como controle interno. Após a normalização com a respectiva expressão GAPDH, verificou-se que as células F-HABP07 possuem uma expressão muito maior de Beclin 1 a 36 h e 60 h de crescimento do que a sua contrapartida normal. Pelo contrário, sua expressão diminuiu para o nível quase basal a 48 h de crescimento, quando foi observado mais número de vacúolos nas células transformadas (Figura 2A). Em continuação, verificamos o nível de expressão de outro marcador de autofagia, a forma lipidada de proteína leve associada a microtúbulos 3 (MAP-LC3-II). MAP-LC3, um homólogo do Apg8 é essencial para a autofagia e está associado à membrana autofagosoma após o processamento. Quando os lisados ​​de células inteiras de F111 e F-HABP07 crescidos durante 36, 48 e 60 h foram submetidos a análise de imunotransferência (Figura 2B.1) utilizando o anticorpo MAP-LC3, apresentou uma expressão muito maior de MAP-LC3-II a 48 h de crescimento. Isso coincidiu com a observação de vacuolas geradas ao máximo nesse ponto de tempo. A análise imunocitoquímica (Figura 2B.2) também mostrou uma maior expressão da proteína MAP-LC3 em células F-HABP07 em todos os pontos do tempo. A expressão da DRAM de proteína lisossômica, conhecida como modulador de autofagia, também foi observada como maior em células F-HABP07 em comparação com F111 durante os três períodos de tempo. Mas a expressão da DRAM é maior durante 36 h e maior a 60 h de crescimento, coincidindo com a indução da apoptose (Figura 2C.1). A análise imunococoquímica (Figura 2C.2) também indica uma expressão semelhante à observada na experiência Western Blot.
A redução da formação de vacuolo é transientemente eficaz com a inibição da quinase PI3.
Já foi relatado que ambos ROS e PI3 quinase desempenham um papel importante na formação de vacúolos autofágicos. A PI3 quinase de classe III que faz parte do complexo de iniciação está de fato envolvida com a geração de ROS, enquanto que a PI3-quinase da classe I foi inciada na autofagia. Para verificar como a via PI3-quinase está envolvida na vacuolagem autofágica no sistema F-HABP07, as células foram submetidas a tratamento com 3-metil-adenina (3-MA). 3-MA, um conhecido inibidor de quinase PI3, também é um inibidor clássico da via autofágica. Como as células F-HABP07 foram observadas como tendo a maior quantidade de vacúolos com aumento de cerca de 6 vezes nas ROS às 48 h de crescimento, elas foram submetidas a tratamento com 0,1 mM, 1 mM e 10 mM de 3-MA durante 30 min. Após as células de tratamento foram coradas com hematoxilina e eosina e depois submetidas a microscopia óptica e as vacúolas foram contadas. A Figura 3A demonstra que a frequência de vacuola por 100 células não foi significativamente afectada para as células F-HABP07 tratadas com diferentes concentrações de 3-MA em comparação com as células de controlo. Para examinar se o 3-MA pode afetar a vacuolagem autofágica no ponto de tempo anterior, quando o nível de ROS foi menor, as células F-HABP07 foram submetidas a tratamento com 10 mM de 3-MA por 30 min a 32, 42 e 48 h. Após a realização da coloração com H-E, as vacúolas foram contadas em células F-HABP07. Freqüência de vacuola em F-HABP07 por 100 células contadas após o tratamento com inibidor de PI3-quinase 3-MA e então a coloração HE revelou que a freqüência de vacuola diminuiu significativamente em cerca de 40% no tratamento a 32 h, mas permaneceu inalterada nos outros pontos de tempo ( Figura 3B). Assim, 3-MA é eficaz na redução da formação de vacuola até 32 h e não além.
O tratamento com bafilomicina A1 revela degradação autofágica aumentada ocorrendo em células F-HABP07.
A coloração com MDC positivo para autofagosomas tem sido observada em células F-HABP07 durante 36, 48 e 60 h de crescimento com aumento da expressão de MAP-LC3-II durante 36 e 48 h em comparação com células F111. Os autofagosomas aumentados podem resultar de aumento do fluxo autofágico ou atraso no tráfico do lisossoma, fusão reduzida entre os dois compartimentos e atividade protéolítica lisossômica prejudicada [36]. Por isso, para elucidar se a degradação autofágica está realmente ocorrendo nos fibroblastos sobreexpressos HABP1, tanto as células F111 quanto as F-HABP07 foram submetidas ao tratamento com Baf A1, de acordo com o protocolo sugerido por Rubinsztein e o grupo [36]. As células F-HABP07 após o tratamento com Baf A1 (50nM) durante 6 h, administradas a 36 e 48 h de crescimento, revelaram uma expressão aumentada de MAP-LC3-II como evidente a partir do aumento da dobra (Figura 4A). O nível elevado de MAP-LC3-II nas células F-HABP07, semelhante ao já observado, também é evidente a partir da análise de imunoblot das amostras das células F111 e F-HABP07 não tratadas de Baf A1 após a normalização com GAPDH (Figura 4A e Figura 4B). A observação acima revelou um aumento no fluxo autofágico em fibroblastos normais após a sobre-expressão de HABP1.
O tratamento com o inibidor de proteassoma MG132 leva a morte celular em fibroblastos de sobreposição de HABP1.
As células têm dois caminhos degradativos para a eliminação de proteínas dobradas e o volume de negócios das matérias-primas, a via de degradação proteasomal e a maquinaria autofágica. Quando a via proteasomal é bloqueada, as células tendem a compensar pelo outro caminho. Para examinar o efeito nas células que geram vacúolos autofágicos, as três linhas de células F111, F-HABP07 e F-pCDNA01 foram tratadas com o inibidor de proteassoma conhecido MG132 (5mM, 12 h) às 32 h e 36 h de crescimento e, em seguida, processado para coloração HE. Na análise microscópica observou-se que as células F-HABP07 sofrem morte celular em ambos os casos, enquanto que as células F111 e F-pCDNA01 apresentam ramificações na forma de muitas estruturas vacuolares (Figura 5), ​​sugerindo que na inibição da degradação proteasomal em F111 e F-pCDNA01, as células podem estar passando por degradação autofágica. Mas, as células F-HABP07 que geraram vacuolas autofágicas devido ao excesso de ROS não poderiam sofrer estímulos de sobrevivência autofágicos adicionais, mas passaram a morte celular.
Regulação ascendente de supressores de tumor e proteínas relacionadas ao supressor de tumor no fibroblasto transformado com HABP1 F-HABP07.
Os lisados ​​de células inteiras preparados a partir de F111 e as células de fibroblasto transformadas em HABP1 (F-HABP07) foram resolvidos por SDS-PAGE, transferidos e imunotransferidos com anticorpos para os supressores de tumores PTEN e p53. O aumento da dobra foi calculado para cada ponto do tempo (F-HABP07 versus F111) e representado após a normalização com GAPDH e tubulina, respectivamente, com a ajuda do ImageJ. A análise imunocitoquímica também foi feita para as duas linhas celulares cultivadas nos períodos de tempo acima mencionados com anticorpos contra PTEN e p53. Os resultados indicam que a expressão de PTEN aumentou em células F-HABP07 com aumento do tempo de crescimento de 36 para 60 h, juntamente com a translocação nuclear do supressor de tumores a 48 e 60 h de crescimento (Figura 6A.1 e Figura 6A.2 ). A expressão do outro supressor de tumor p53 foi maior a 36 e 60 h em células F-HABP07 em comparação com células F111 (Figura 6B.1). A análise imunocitoquímica também mostrou maior expressão e localização nuclear de p53 em F-HABP07 às 60 h de crescimento (Figura 6B.2).
A despolimerização por hialuronano e a sua depleção em excesso de ROS gerando HABP1 sobreexpressando fibroblasto.
Vários relatórios sugerem que o HA, que está abundantemente disponível em fluidos biológicos, é degradado em condições patológicas, provavelmente por causa da indolmazina induzida pela desmiquidação mediada por radicais livres da cadeia HA [38-40]. A depolimerização de HA induzida por radicais livres é um fenômeno bem caracterizado em que HA atua como um eliminador de ROS [41]. Assim, nossa observação do excesso de geração de ROS devido à acumulação de HABP1 mitocondrial [16] nos levou a comparar o perfil de HA e HABP1 nas três linhas celulares. A coloração citoquímica de HA e HABP1 na Figura 7A em fibroblastos normais indicou sinais fortes e colocalização no citoplasma, confirmando nossa observação anterior do papel de HABP1 na sinalização celular mediada por HA. No entanto, na linha celular F-HABP07 não só houve uma sinalização HA reduzida, provavelmente gerando oligómeros HA; mas HABP1 não colocalizou com HA, mesmo que o nível de HABP1 seja elevado nessa linha celular. Assim, a micrografia da coloração citoquímica para HA exibiu claramente a despolimerização e a redução significativa no nível de HA nas células F-HABP07 em comparação com as células de controle parental a 60 h de crescimento (Figura 7A). Esta observação foi ainda validada estudando a redução e despolimerização de HA em células F-HABP07 usando o fraccionamento de HA polimérico e os oligossacarídeos de HA degradados de baixo peso molecular por eletroforese em gel de gradiente de poliacrilamida. Verificamos o estado da HA polimérica nas duas linhas celulares F111 e F-HABP07. As fracções enriquecidas em HA purificadas a partir das duas linhas celulares cultivadas durante 60 h foram digeridas com hialuronidase testicular bovina (BTH) ou mantidas sem tratamento. Subsequentemente, os produtos não digeridos e digeridos com BTH foram executados num gel de gradiente de poliacrilamida a 5-20% de acordo com o procedimento descrito em & # x02018; Materials and Methods; # x02019; para separar os vários fragmentos de HA. O HA polimérico permaneceu na extremidade superior do gel enquanto que; A HA degradada por BTH migrou para a outra extremidade. Usando HA purificado a partir das duas linhas celulares, um nível de HA polimérico significativamente diminuído em F-HABP07 em comparação com F111 foi claramente evidente nas bandas superiores do gel corado com nitrato de prata. Mais frações oligoméricas foram encontradas no F-HABP07 do que HA polimérico. O HA polimérico mais desapareceu após o tratamento subsequente com BTH (Figura 7B). The expression level of HAS2 was found to be almost similar in both F111 and F-HABP07 upon immunoblotting ( Figure 7C ); suggesting that reduction in HA is not at the level of synthesis, but due to degradation.
Reversal of ROS induced autophagic vacuole formation by supplementation of polymeric HA, an endogenous ROS scavenger.
To examine whether the known endogenous ROS scavenger HA has any rejuvenating effect on the cellular homeostasis of F-HABP07, these cells along with the control normal fibroblasts were supplemented exogenously with polymeric HA (150 μg/ml) in the culture medium at 36 h. As shown in Figure 8A , the fluorescence intensity of ROS sensitive dye H 2 DCFDA in F-HABP07, significantly reduced after HA supplementation. Dense elongated F-HABP07 cells with broader diameter were visualized under phase contrast after HA supplementation along with reduced fluorescence when compared with untreated controls ( Figure 8A ). Moreover, the ROS level assayed fluorometrically after using H 2 DCFDA, showed significant quenching of ROS up to 8 folds in F-HABP07 cells after polymeric HA supplementation ( Figure 8B ). Simultaneously, the growth rate of HA treated and untreated cells was assayed using MTT dye. According to earlier reports growth retardation was observed in untreated F-HABP07 cells as compared to F111 cells. Supplementation of polymeric HA significantly restored the growth of F-HABP07 cells by about 25% as evident from the cell viability curve ( Figure 8C ). Reduction in ROS level after HA supplementation suggests a role of HA as a ROS scavenger. To correlate ROS level and the appearance of vacuoles with polymeric HA supplementation, reduction in number of vacuolated cells were discerned in F-HABP07 using the autophagic marker, the fluorescent dye MDC. Polymeric HA supplementation resulted in the significant reduction of vacuolated cells by about 50 % in F-HABP07 cells; while the parental cell line showed no significant change ( Figure 8D ). However, if supplementation was given at a later time, there was insignificant change in the number of vacuoles (unpublished observation).
Contrarily, o-HA supplementation similar to polymeric HA supplementation showed negligible fold change in ROS ( Figure 8E ) and cell growth in F111 and F-HABP07 cells ( Figure 8F ). Immunostaining with anti-MAP-LC3 for the autophagic marker indicated that the expression of the protein remains unchanged in F111 cells after o-HA treatment. However, the upregulated MAP-LC3 in F-HABP07 cells not only remains upregulated but also gets translocated to nucleus upon o-HA supplementation ( Figure 8G ).
These observations imply that external supplementation of o-HA at 36 h does not affect the redox and autophagic status of F111 which has high level of polymeric HA. Conclusively, our overall findings also suggest that ROS induced autophagic vacuoles in F-HABP07 cells can be reverted by the supplementation of ROS scavenger or antioxidant, polymeric HA.
Discussão.
Autophagy, primarily a catabolic process, involving the regulated turnover and elimination of proteins and cellular organelles, promotes survival under metabolic stress, but it can also be a mediator of cell death if executed to completion [42]. Although not much is known about its precise regulation, the ability of a large number of stimuli to trigger autophagy suggests the implication of numerous signaling pathways responsible for the formation of autophagosomes. Autophagy has been supposed to be modulated by mainly two regulatory proteins; firstly mammalian target of rapamycin (mTOR), a cell growth regulator integrating growth factor and nutrient signals and secondly AMP activated protein kinase (AMPK), a key energy sensor regulating metabolism. AMPK promotes autophagy through inactivation of the nutrient sensitive mTOR complex 1 (mTORC1) [43,44]. AMPK mainly considered as a pro-survival kinase might lead to cell death upon sustained activation [44] and one of the factors implicated in its activation is oxidant stress or ROS [45]. Using a stable fibroblast cell line overexpressing HABP1, which generates excess ROS and subsequently undergoes apoptosis; we confirmed ROS-mediated regulation of autophagy prior to apoptosis as evident from the following observations. Increased autophagic vacuoles were observed in F-HABP07 cells during oxidative stress as revealed from MDC staining. Period of autophagic vacuolation demonstrated upregulation of autophagic markers Beclin 1, MAP-LC3-II and the autophagic modulator, the lysosomal protein DRAM. Vacuole formation in F-HABP07 was reduced by 3-MA, the known inhibitor of autophagy. Inhibition of lysosomal proteolysis by Baf A1 confirmed increased autophagic flux taking place upon HABP1 overexpression in normal fibroblasts. Proteasomal inhibitor induced vacuole formation was observed in F111 and vector transformed fibroblasts, whereas F-HABP07 underwent cell death, perhaps due to extreme stress. At 60 h of cell growth the expression of tumor suppressors PTEN and p53 were elevated in F-HABP07 cells coinciding with apoptosis induction. Excess ROS generation in F-HABP07 was instrumental in the appearance of autophagic vacuoles and reduced level of the endogenous ROS scavenger, HA. This can be corroborated with the observation of decline in autophagic vacuole formation due to diminished ROS level after external supplementation of polymeric HA.
Autophagy, the evolutionarily conserved stress response system, was evident in HABP1 transformed fibroblast cells (F-HABP07) when the cells were undergoing oxidative stress, but the oxidant level showed a steep rise from 48 h to 60 h of growth (about 6 to 12 fold) [16]. Subsequent to administration of 3-MA, a potent PI3-kinase inhibitor, inhibition of autophagic vacuolation in this cell line was only possible in the early period of growth (32 h). This observation suggested that once a high level of ROS (6 to12 fold) is attained, the process of autophagy cannot be attenuated.
Beclin 1 is a component of the nucleation complex that along with class III PI3K/p150 forms a part of the initial stage of the process of autophagy; which might be the reason for its higher expression at 36 h in F-HABP07 cells. While, expression of MAP-LC3-II, a part of the autophagic membrane complex, was highest at 48 h of growth; corroborating with the observation of the maximum number of vacuoles at that stage. The expression of Beclin 1 decreased to basal level at 48 h, as autophagic vacuoles were already formed by that time. But, since the cells showed a surge in ROS from 48 h to 60 h of growth, they tried to adapt to that oxidative stress that is evident from the increased expression of Beclin 1. From the observations it was apparent that the cells were unable to overcome the stress and a fall in mitochondrial membrane potential (Δψ m ) was witnessed at 60 h of growth along with apoptosome complex formation. As reported earlier, the cells were found to undergo apoptosis at 72 h of growth. Moreover, mitochondrial accumulation of HABP1/p32/gC1qR has been reported to inhibit respiratory chain complex I activity [16]. Thus, it is conceivable that the very same cell line exhibits excess ROS generation, autophagy and apoptosis. ROS generated as a by-product in the mitochondrial electron transport chain can act as signaling molecules to regulate pathways leading to both cell survival and cell death. Autophagic vacuolation has been reported to act as a cell survival strategy during starvation-induced oxidative stress [25,26]. Our observations relating to the inhibition of ETC complex I and autophagy corroborates with a recent report [27] where inhibition of the mitochondrial electron transport chain (mETC) by inhibitors rotenone and TTFA blocked Complex I and Complex II respectively resulting in autophagic cell death of HEK 293, cancerous cell lines U87 and HeLa cell lines by the generation of ROS. Additionally, the induction of both autophagy and apoptosis has also been reported in the human Glioma U251 cells upon oxidative stress [46]. Autophagy and apoptosis may be triggered by common upstream signals [47,48], and sometimes these result in combined autophagy and apoptosis. In other instances, the cell switches between the two responses in a mutually exclusive manner [49].
Our observation on role of HABP1 in autophagic regulation can be supported by the previous report indicating the physical interaction of HABP1/ p32 with both murine and human smARF, an autophagy inducer. HABP1/ p32 co-localizes to the mitochondria with these short isoforms, stabilizes the mitochondrial smARF which otherwise is short-lived and undergoes degradation by proteasome-mediated process. Knocking down p32 protein by p32 siRNA significantly reduces the steady state levels of smARF by increasing its turnover and thus reduction in autophagy and mitochondrial membrane dissipation [33,34]. Although this protein is ubiquitous in nature, it is not expressed equally throughout the cells. It shows differential localization in different cells lines under various physiological conditions leading to multivariate binding of ligands and thus explaining its multifunctionality. Mitochondrial localization of HABP1 in F-HABP07 has already been reported from our laboratory [16]. Recent report suggests the involvement of p32/HABP1 in autophagy for promoting degradation of parkin, a neuroprotective protein functioning as E3 ligase in ubiquitin proteasome system (UPS) [50]. Parkin targets several substrates for ubiquitination and defective mitochondria for autophagy. Thus, p32 has been proposed to regulate mitochondrial morphology and dynamics by amending parkin protein level via autophagy [50]. Out of the two major degradative pathways present in a cellular system, the UPS is majorly involved in the degradation of short-lived proteins while the conserved autophagic system is involved with the elimination and recycling of worn out long lived proteins and organelles. Suppression of the UPS leads to the build-up of misfolded proteins in the ER, which may cause significant ER stress. It has been demonstrated that autophagic degradative machinery responds and compensates for the inhibition of the proteasomal system to regulate ER stress and cell viability [51]. Our study indicated that MG132 treatment proved fatal for F-HABP07 cells that were pre-stressed due to excess generation of ROS leading to autophagic manifestation and could not sustain subsequent stress from the inhibition of proteasomal degradation.
Our observation on upregulation and nuclear translocation of the tumor suppressor PTEN, during 60 h of growth in F-HABP07 also coincided with a huge surge in ROS generation from 48 to 60 h and induction of apoptosis [16]. PTEN is implicated in autophagy by the inhibition of Akt/PKB signaling mediated by its lipid phosphatase activity [29]. It is reported to be constitutively active during elevated ROS levels and is a crucial and common mediator in ROS generation and neuronal cell death [52]. Also, there are several reports linking overexpression or induced expression of PTEN with cell cycle arrest and induction of apoptosis in several types of cells, like MCF-7, Jurkat T cells, fibroblasts etc. [53-55]. Also, the data showing increased expression of p53 at 60 h appears to support the ROS-mediated apoptosis, implying ROS as an upstream signal triggering p53 activation and a downstream factor that regulate apoptosis [56]. A microarray analysis of H 2 O 2 - treated human cells identified one-third of the 48 highly H 2 O 2 - responsive genes as targets of p53 [57]. At basal or physical levels, p53 has a subtle but vital function in maintaining ROS at non-toxic levels through transactivation of several antioxidant genes. On the contrary, overexpression of p53 transactivates a series of p53-induced genes (PIGs) and many of these PIG s encode redox-active proteins including two ROS-generating enzymes, NQO1 (quinoneoxidoreductase, PIG3) and proline oxidase (POX, PIG6). Upregulation of these pro-oxidant enzymes leads to oxidative stress and consequently to apoptosis [56,58]. Apart from the role of p53 in apoptosis, it has also been incriminated to have a function in autophagy. The p53 activation is implicated in the repression of mTOR leading to autophagy [59]. Also p53 can transactivate target genes like DRAM and PTEN which are believed to have a crucial role in the regulation of autophagy [60,61]. Overexpression of DRAM leads to accumulation of autophagic vacuoles, while it’s silencing is associated with downregulation of both autophagy and apoptosis [60,62,63]. Thus, increased expression of p53 and DRAM seem to play an important role in the appearance of autophagic vacuoles and induction of apoptosis in the HABP1 transformed fibroblasts, F-HABP07.
Excess ROS is also known for its degradative action on HA polymer, generating HA oligosaccharides owing to its ROS scavenging property [64,65]. This could be instrumental in substantial reduction in polymeric HA level observed in the HABP1 overexpressing fibroblast generating excess ROS. This conceivably is reflected in significant reduction in the number of vacuoles in F-HABP07 observed at 60 h upon polymeric HA supplementation (150µg/ml) exogenously at 36 h. Reduction in level of ROS generation was evident in the HA supplemented F-HABP07 cells, from the decreased fluorescence intensity upon H 2 DCFDA treatment. But, supplementation of HA at a later stage did not show a similar outcome (unpublished observation). The induction of apoptosis after 60 h may be related to the ROS-induced depolymerization of HA since; HA oligosaccharides are reported to be involved in signaling cascades inhibiting anchorage-independent growth of several cell types and induction of apoptosis [9]. It has also been suggested that HA oligomers stimulate the expression of PTEN [66-68], a phosphatase that suppresses the PI3-kinase/AKT cell survival pathway leading to cell growth inhibition and apoptosis. Earlier report from our laboratory has revealed that supplementation of known antioxidants like pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC), N-acetyl-cysteine (NAC), tiron and curcumin reduces oxidative stress in F-HABP07 and the cell line can serve as a tool to identify unknown antioxidants [69]. Co-localization studies between HA and HABP1 and mitotracker in F111 and F-HABP07 revealed differential interaction between HA-HABP1 in the two cell lines [16, supplementary data]. Oligomeric fragments of HA in F-HABP07 did not colocalize with the mitochondrially localized HABP1 leading to mitochondrial dysfunction [16], indicating a disruption of the normal physiological event of HA-HABP1 interaction which is otherwise occurring in normal fibroblasts. Additionally, our present data is supported by a recent report of the cytoprotective activity of HA on oxidatively stressed chondrocytes indicated by decreased mitochondrial DNA damage, enhanced DNA repair capacity, increased cell viability and reduced rate of apoptosis [70].
Conclusão.
We report that overexpression of HABP1 in normal fibroblasts induces autophagy with the upregulation of autophagic markers and modulators in a ROS-dependent pathway that depolymerizes the endogenous antioxidant HA. This autophagic vacuolation could be inhibited only in the early redox stage either by inhibition of PI3 kinase activity or the use of antioxidants like polymeric hyaluronan.
Funding Statement.
KD received financial support from Department of Biotechnology (DBT), Government of India, New Delhi. IG is financially supported by Department of Science and Technology (DST), Government of India, New Delhi. PS obtained individual fellowship for her doctoral work from Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), New Delhi, India. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

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